จากหิ้งสู่ห้าง…ผลิตภัณฑ์ปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต
ภาวนา ลิกขนานนท์ วิทยา ธนานุสนธิ์ ประพิศ แสงทอง สุปรานี มั่นหมาย
กลุ่มวิจัยปฐพีวิทยา สำนักวิจัยพัฒนาปัจจัยการผลิตทางการเกษตร
__________________________________________
บทคัดย่อ
การศึกษาหาจุลินทรีย์ที่มีในประเทศเพื่อนำมาผลิตเป็นปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต ดำเนินการศึกษาตามขั้นตอนต่างๆ ตั้งแต่รวบรวมจุลินทรีย์ที่มีคุณสมบัติละลายฟอสเฟตจากตัวอย่างดินและรากพืชแล้วคัดเลือกจุลินทรีย์นั้นให้ได้จุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพในการละลายหินฟอสเฟตชนิดต่างๆ ในสภาพห้องปฏิบัติการ ศึกษาการใช้จุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้ร่วมกับหินฟอสเฟตในสภาพ micro-plot และสภาพแปลงทดลอง ศึกษาการละลายของฟอสฟอรัสรูปต่างๆ ทั้งอนินทรีย์และอินทรีย์ฟอสฟอรัสที่ถูกยึดตรึงอยู่ในดิน โดยจุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้ เมื่อได้จุลินทรีย์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมจึงศึกษาวิธีการผลิตจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟตให้เป็นรูปแบบปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟตที่พร้อมนำไปใช้ประโยชน์
ผลการศึกษาได้จุลินทรีย์ที่สามารถละลายตะกอน CaHPO4 ที่ระยะเวลา 3 วัน ได้วงใสรอบโคโลนี.ของจุลินทรีย์มากกว่า 9 มิลลิเมตร จำนวน 60 ไอโซเลท. และคัดเลือกจุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพละลายหินฟอสเฟตชนิดต่างๆ จากจุลินทรีย์ 60 ไอโซเลท. ได้เชื้อราในสกุล Penicillium 3 ไอโซเลท. และเชื้อแบคทีเรีย 2 ไอโซเลท. เมื่อศึกษาการใช้จุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้ร่วมกับหินฟอสเฟตในสภาพ micro-plot และสภาพแปลงทดลอง พบว่า การเพาะเชื้อรา Penicillium spp. ทั้ง 3 ไอโซเลท. ร ่วมกับการใส่หินฟอสเฟตทำให้การเจริญเติบโตและการให้ผลผลิตของพืชทดสอบสูงกว่าการใส่หินฟอสเฟตแต่ไม่เพาะเชื้อรา
นอกจากนี้พบว่า การเพาะเชื้อรา Penicillium spp. ลงดินชุดต่างๆ ทำให้ค่าฟอสฟอรัส.ทั้งหมดที่เป็นประโยชน์ในดิน อนินทรีย์ฟอสฟอรัส.และอินทรีย์ฟอสฟอรัส.สูงขึ้นกว่าการไม่เพาะเชื้อรา โดยเฉพาะอินทรีย์ฟอสฟอรัส.มีปริมาณเพิ่มสูงขึ้นอย่างเด่นชัด เมื่อทดลองผลิตเชื้อรา Penicillium sp. ให้อยู่ในรูปแบบปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต.ที่พร้อมนำไปใช้ประโยชน์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ พบว่าการเลี้ยงเชื้อราในลักษณะ solid substrate fermentation ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีข้าวฟ่าง.เป็นส่วนประกอบหลัก ทำให้ได้สปอร์จำนวนมากและมี shelf life ที่นานเพียงพอ และสามารถใช้ปุ๋ยหมักมูลวัวบดละเอียดเป็นวัสดุพาหะ สำหรับการผลิตปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต.
คำนำ
ฟอสฟอรัส.เป็นธาตุอาหารหลักที่มีบทบาทสำคัญต่อการเจริญเติบโตของพืช ฟอสฟอรัส.ปรากฏในธรรมชาติในรูปอินทรีย์และอนินทรีย์ฟอสฟอรัส. ความเข้มข้นของฟอสฟอรัส.ในดินอยู่ในช่วง 0.02 - 0.5 เปอร์เซ็นต์ โดยมีค่าเฉลี่ยประมาณ 0.05 เปอร์เซ็นต์ (Barber, 1984) และส่วนใหญ่อยู่ในรูปออร์โท ฟอสเฟต.
ฟอสฟอรัสในดินโดยทั่วไปจำแนกได้เป็น
(ก) ฟอสฟอรัสในสารละลายดิน
(ข) อนินทรีย์ฟอสฟอรัส ..... และ
(ค) อินทรีย์ฟอสฟอรัส
ฟอสฟอรัส.ในสารละลายดินที่จัดว่าเป็นประโยชน์ต่อพืชมีปริมาณน้อยมาก เนื่องจากฟอสฟอรัส.เป็นธาตุที่ทำปฏิกิริยากับสารประกอบต่างๆ ในดินได้ดี ดังนั้นดินที่ไม่มีการใส่ปุ๋ยจึงมีฟอสฟอรัส.ในสารละลายดินประมาณ 0.05 มก./ลิตร หรือพบน้อยมากที่จะเกิน 0.3 มก./ลิตร (Ozanne, 1980) ส่วนอนินทรีย์ฟอสฟอรัส.ในสารละลายดินอยู่ในรูปของออร์โท ฟอสเฟต. (H2PO4-1และ HPO4-2) ขึ้นอยู่กับค่าความเป็นกรด-ด่าง (pH) สำหรับอินทรีย์ฟอสฟอรัส.ในดินทั่วไปนั้น พบว่า มีค่าอยู่ระหว่าง 30-50 เปอร์เซ็นต์ ของฟอสฟอรัส. ทั้งหมดในดิน (Paul and Clark, 1989) โดยอาจจะมีถึง 50 เปอร์เซ็นต์ในดินที่มีอินทรีย์วัตถุสูง (Barber, 1984) และประพิศ (2534)
รายงานว่าดินไร่ของประเทศไทยมีอินทรีย์ฟอสฟอรัส.อยู่ถึง 35 เปอร์เซ็นต์ของฟอสฟอรัส.ทั้งหมดในดิน ซึ่งฟอสฟอรัส.รูปนี้จะเป็นประโยชน์ต่อพืชเมื่อถูกปลดปล่อยออกมาโดย จุลินทรีย์ในดิน ดินส่วนใหญ่มีอนินทรีย์ฟอสฟอรัส.อยู่ในรูปที่ไม่ละลายจึงเป็นฟอสฟอรัส.ที่ไม่เป็นประโยชน์ต่อพืช ในขณะที่ดินส่วนใหญ่มีแหล่งสำรองของธาตุฟอสฟอรัส. แต่ฟอสฟอรัส.ในแหล่งสำรองนี้คงอยู่ในสภาพที่เป็นประโยชน์น้อย เพราะถูกดินดูดตรึงเอาไว้ และด้วยเหตุที่ฟอสฟอรัส. มีปฏิกิริยาทางเคมีมาเกี่ยวข้องหลายประการ จึงมีฟอสฟอรัส.น้อยกว่า 10 เปอร์เซ็นต์ที่เข้าสู่วัฏจักร พืช สัตว์ ดังนั้นการขาดฟอสฟอรัส. จึงเป็นปัญหาที่พบอย่างกว้างขวาง การใส่ปุ๋ยฟอสเฟต. จึงจำเป็นเพื่อให้ได้ผลผลิตสูงเพื่อการพัฒนาการเกษตรอย่างยั่งยืน
การใช้ประโยชน์จากจุลินทรีย์หลากหลายชนิด กำลังเป็นที่สนใจเพราะประชากรจุลินทรีย์เป็นส่วนประกอบหลักของระบบ ดิน-พืช การที่ประชากรจุลินทรีย์มีส่วนเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์นี้จะมีผลต่อการพัฒนาของพืช มีจุลินทรีย์ดินหลายชนิดที่สามารถละลายไอออน ฟอสเฟต.
จากสารประกอบอนินทรีย์ฟอสฟอรัส. แต่ไอออน ฟอสเฟต.รูปที่ละลายออกมานี้จะถูกดินตรึงไว้อีกครั้ง ก่อนที่จะถึงผิวรากพืช การใช้หินฟอสเฟต.ซึ่งเป็นแหล่งฟอสฟอรัส.ต้นทุนต่ำจึงเป็นทางเลือกอีกทางหนึ่ง ปัญหาของการใช้หินฟอสเฟต. คือ ประสิทธิภาพในการใช้ต่ำ ไม่เป็นประโยชน์ต่อพืชในดินที่มีค่า pH มากกว่า 5.5-6 แม้ว่าเมื่อสภาพแวดล้อมอื่นๆเหมาะสม ผลผลิตที่ได้ต่ำกว่าพืชได้รับจากปุ๋ยเคมีฟอสเฟต.ที่ละลายได้อื่นๆ (Khasawneh and Doll, 1978)
การใช้หินฟอสเฟต.เป็นปุ๋ยโดยตรงจึงไม่แพร่หลาย อย่างไรก็ตามมีวิธีการหลายวิธีที่ทำให้ฟอสฟอรัส.ในหินฟอสเฟต.เป็นประโยชน์เพิ่มขึ้น เช่น
-วิธีการทางเคมี (วิศิษฐ์ และมนูเวทย์, 2520)
- วิธีทางกายภาพโดยนำอาหินฟอสเฟตไปเผาไฟหรือบดให้ละเอียด (ลัดดาวัลย์ และคณะ, 2532)
- รวมทั้งพบว่ามีจุลินทรีย์หลายชนิดสามารถละลายหินฟอสเฟตออกมาเป็นประโยชน์ได้ (Sperber, 1958; Louw and Weber, 1959; Gerretsen, 1984)
ซึ่งการทำให้ความเป็นประโยชน์ของหินฟอสเฟต.เพิ่มขึ้นจากกระบวนการของจุลินทรีย์ จึงเป็นแนวทางที่น่าจะนำไปถึงจุดมุ่งหมายในการทำการเกษตรอย่างยั่งยืนได้ โดยมีรายงานว่า
จุลินทรีย์สามารถปลดปล่อยกรดอินทรีย์ชนิดต่างๆ ออกมา ทำให้หินฟอสเฟต.เป็นประโยชน์เพิ่มขึ้นเนื่องจากกรดอินทรีย์โมเลกุลต่ำ สามารถเพิ่มความเข้มข้นของฟอสฟอรัส.ในสารละลายโดยกลไก ที่เกี่ยวข้องกับ chelation และปฏิกิริยาแลกเปลี่ยน (Fox and Comerford, 1990; Gerkel, 1992) มีการนำเชื้อราเส้นใยมาใช้ประโยชน์ในการผลิตกรดอินทรีย์อย่างแพร่หลาย (Mattey, 1992; Vassilev and Vassileva, 1992) โดยเฉพาะอย่างยิ่งเชื้อรา Aspergillus niger และ Penicillium sp. บางสายพันธุ์ โดยมีการศึกษาในระบบหมัก
ร่วมกันกับหินฟอสเฟต หรือโดยการเพาะเชื้อโดยตรงเพื่อให้ไปละลายหินฟอสเฟต (Kucey, 1987; Asea etal,1988; Cerezine et al,1988; Cunningham and Kulack, 1992)
กลุ่มงานวิจัยจุลินทรีย์ดิน กลุ่มวิจัยปฐพีวิทยา สำนักวิจัยพัฒนาปัจจัยการผลิตทางการเกษตร
จึงทำการศึกษาจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต.เพื่อคัดเลือกหาจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต.ที่สามารถนำมาใช้ประโยชน์โดยพัฒนาให้อยู่ในรูปแบบปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต.ที่เกษตรกรสามารถนำไปใช้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
วิธีดำเนินการ
1. การรวบรวมจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต
เก็บตัวอย่างดินบริเวณรากพืช (rhizosphere) และรากพืชจากจังหวัดต่างๆ ในภาคเหนือ ภาคใต้ ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ และภาคกลาง แล้วเลี้ยงแยกจุลินทรีย์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ nutrient agar, potato dextrose agar และ actinomycete agar สำหรับจุลินทรีย์ประเภทเชื้อแบคทีเรีย เชื้อรา และเชื้อแอคติโนมัยซิส ตามลำดับ จากนั้นทำการแยกหาจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต.เบื้องต้นบนอาหารเลี้ยงเชื้อ glucose yeast extract agar ที่เทหนา 2 ชั้น (double-layered) โดยมีตะกอน CaHPO4 เป็นส่วนประกอบอยู่ชั้นบนของอาหาร ตามวิธีของ Katznelson and Boss (1959) เพาะจุลินทรีย์แบบจุด (spot-inoculation) แล้วนำไปบ่มเชื้อที่อุณหภูมิตู้บ่มที่ 30 องศาเซลเซียส วัดและบันทึกความกว้างของวงใสที่ปรากฏอยู่รอบโคโลนีจุลินทรีย์เมื่อบ่มได้ 3 และ7 วัน โดยให้คะแนนตามความกว้าง ของวงใสดังนี้ระดับที่ 1. 0 มิลลิเมตร 2. 0-3 มิลลิเมตร 3. 3-6 มิลลิเมตร 4. 6-9 มิลลิเมตร และ 5. มากกว่า 9มิลลิเมตร เก็บรวบรวมเชื้อเดี่ยวที่แสดงความกว้างของวงใสระดับ 6-9 มิลลิเมตร และมากกว่า 9 มิลลิเมตร เพื่อการทดลองขั้นต่อไป
2. การคัดเลือกจุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพละลายหินฟอสเฟต
นำจุลินทรีย์จากขั้นตอนที่ 1 ที่แสดงความกว้างของวงใสระดับ 6-9 มิลลิเมตรและมากกว่า
9 มิลลิเมตร มาคัดเลือกให้ได้จุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพละลายหินฟอสเฟต 2 ชนิด คือ หินฟอสเฟต.กาญจนบุรี และหินฟอสเฟต.ลำพูน ในสภาพห้องปฏิบัติการดังนี้
วางแผนการทดลองแบบ factorial in randomized complete block ทำ 10 ซ้ำ โดยมีปัจจัยที่ 1 เป็นการเพาะและไม่เพาะจุลินทรีย์ ปัจจัยที่ 2 เป็นหินฟอสเฟต 5 อัตราคือ 0.0000 0.2500 0.5000 0.7500 และ 1.0000 กรัมต่ออาหารเลี้ยงเชื้อ 100 มิลลิลิตร เพาะจุลินทรีย์ ที่สามารถละลายตะกอน CaHPO4 ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว Pikovskaya ที่มีหินฟอสเฟต.อัตรา 0.0000, 0.2500, 0.5000, 0.7500 และ 1.0000 กรัมต่ออาหาร 100 มิลลิลิตร pH 6.5 เพาะจุลินทรีย์ประเภทเชื้อรา โดยเจาะขอบของโคโลนี.ของเชื้อราบนอาหารเลี้ยงเชื้อ corn meal agar ด้วย cork borer แล้วเพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ เขย่าที่ 100 รอบต่อนาที บ่มที่อุณหภูมิห้อง เพาะจุลินทรีย์ประเภทเชื้อแบคทีเรีย โดยกำหนดให้ปริมาณเซลล์มีชีวิต เท่ากับ 1 x 108 เซลล์ต่อมิลลิลิตรของอาหารเลี้ยงเชื้อ ตรวจวิเคราะห์ฟอสฟอรัส.ที่ละลายออกมาโดยวิธีของ Watanabe and Olsen (1965) ซึ่งเป็นวิธีวิเคราะห์หาปริมาณฟอสฟอรัส.ที่ละลายน้ำได้โดยการทำให้เกิดสีด้วยกรดแอสคอบิก. ที่ระยะเวลาบ่ม 7 14 และ 28 วันสำหรับจุลินทรีย์ประเภทเชื้อราและที่ระยะเวลาบ่ม 3 7 และ 14 วันสำหรับจุลินทรีย์ประเภทเชื้อแบคทีเรีย เปรียบเทียบผลระหว่างการเพาะ และไม่เพาะจุลินทรีย์ จากนั้นเก็บเชื้อที่คัดเลือกแล้วในอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งเอียงเพื่อการทดลองต่อไป
3. ศึกษาการใช้จุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้ร่วมกับหินฟอสเฟตใน micro-plot และสภาพแปลงทดลอง ทำการทดลองใน micro-plot จำนวน 15 แปลงและแปลงปลูก 10 แปลง ที่จังหวัดขอนแก่นและกำแพงเพชร ในฤดูฝนและฤดูแล้ง โดยปลูกถั่วเหลืองและข้าวโพดเป็นพืชทดสอบ เพราะพืชทั้งสองชนิดมีการตอบสนองต่อฟอสฟอรัส ถ้าปริมาณฟอสฟอรัสไม่เพียงพอ จะแสดงการขาดฟอสฟอรัสออกมาให้เห็นค่อนข้างชัด ชุดดินที่ใช้ในการทดลอง จึงต้องคัดเลือกในขั้นต้นให้มีปริมาณฟอสฟอรัสที่มีประโยชน์ในดินต่ำกว่าค่าวิกฤตของพืช ซึ่งมีค่าประมาณ 10 มก./กก. การทดลองนี้ได้ดำเนินการระหว่างปี 2542-2547 ทดลองทั้งใน micro-plot และในแปลงแบบ randomized complete block ทำ 4-8 ซ้ำ การทดลองใน พ.ศ. 2543-2544 เป็นการทดลองใน micro-plot มีกรรมวิธีการทดลอง 14 กรรมวิธี
โดยมีกรรมวิธี
1)ไม่ใส่หินฟอสเฟตไม่เพาะเชื้อ
2) ใส่ปุ๋ยฟอสเฟต
3) ใส่หินฟอสเฟตอัตรา 5 มก./กก.
4) ใส่หินฟอสเฟต 10 มก./กก. และ
5)-14) ใส่หินฟอสเฟต 2 อัตรา คือ 5 และ 10 มก./กก.ร่วมกับการเพาะเชื้อจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต.แต่ละไอโซเลท. ได้แก่ เชื้อแบคทีเรีย 2 ไอโซเลท. คือ RPS 013 B และ RPS 042 B และเชื้อรา 3 ไอโซเลท. คือ RPS 003 F, RPS 032 F และ RPS 145 F ส่วนการทดลองในปี พ.ศ. 2544 ที่จังหวัดกำแพงเพชร และการทดลองในทั้งสอง จังหวัดในปี พ.ศ. 2545 เป็นการทดลองใน micro-plot และแปลงทดลอง แต่ลดกรรมวิธีการทดลองเหลือ 6 กรรมวิธี โดยลดการใส่หินฟอสเฟต.ลงเหลือเพียงอัตราเดียวและไม่ใช้ จุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต.ประเภทเชื้อแบคทีเรีย ในปี พ.ศ. 2546 ปรับกรรมวิธีการทดลองเป็น 10 กรรมวิธีโดยเพิ่มกรรมวิธีการทดลองเพาะเชื้อราละลายฟอสเฟต.ร่วมกับหินฟอสเฟต.อัตรา 200 กก./ไร่ และเพาะเชื้อราร่วมกับปุ๋ยเคมีฟอสเฟต.ครึ่งอัตรา
ขั้นตอนการทดลอง
3.1 เตรียมหัวเชื้อจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต[/color]
โดยเลี้ยงขยายจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟตบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม โดยเชื้อแบคทีเรีย เลี้ยงขยายปริมาณบนอาหารเลี้ยงเชื้อ nutrient agar แล้วเก็บเชื้อใส่ลงในน้ำเกลือ 0.85 เปอร์เซ็นต์ เพื่อเตรียมสารละลายเชื้อแบคทีเรียที่มีความเข้มข้นประมาณ 1 x 1010 เซลล์ต่อมิลลิลิตร สำหรับเชื้อรา เลี้ยงขยายปริมาณบนอาหารเลี้ยงเชื้อ malt yeast extract agar เพื่อเตรียมเชื้อตั้งต้น จากนั้นขยายจำนวนสปอร์ราบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีส่วนประกอบเป็นข้าวฟ่างและรำข้าวแล้วบ่มเชื้อไว้
3.2 ปลูกพืชทดลองและเพาะจุลินทรีย์ใน micro-plot[/color]
ทำ micro-plot โดยใช้แผ่นสังกะสีขดเป็นวงกลมขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 50 เซนติเมตร
สูง 25 เซนติเมตรและฝังดินลึก 20 เซนติเมตร ในการปลูกถั่วเหลืองปลูก 6 ต้นต่อ micro-plot ในทุกกรรมวิธีการทดลอง ใส่ปุ๋ยรองพื้น 12 กิโลกรัม N ต่อไร่ และ 6 กิโลกรัม K2O ต่อไร่ การใส่หินฟอสเฟตให้ใส่ในกรรมวิธี ตามอัตราที่กำหนด การใส่ปุ๋ยฟอสเฟตให้ใส่ 9 กิโลกรัม P2O5 ต่อไร่ แล้วเพาะหัวเชื้อจุลินทรีย์ที่เตรียมไว้ สำหรับข้าวโพด ปลูก 2 ต้นในแต่ละ micro-plot ใส่ปุ๋ยรองพื้น 20 กิโลกรัม N ต่อไร่ และ 10กิโลกรัม K2O ต่อไร่ การใส่หินฟอสเฟตให้ใส่ในกรรมวิธี ตามอัตราที่กำหนด การใส่ปุ๋ยฟอสเฟตให้ใส่ 20 กิโลกรัม P2O5 ต่อไร่ แล้วเพาะหัวเชื้อจุลินทรีย์
3.3 ปลูกพืชทดลองและเพาะจุลินทรีย์ในสภาพแปลง[/color]
ปลูกถั่วเหลืองในแปลงขนาด 3 x 6 เมตร ระยะปลูก 50 x 20 เซนติเมตร ปลูกข้าวโพดในแปลงขนาด 3 x 6 เมตร ระยะปลูก 75 x 25 เซนติเมตร ใส่ปุ๋ยให้ถั่วเหลืองและข้าวโพดในอัตราที่เหมือนกับการทดลองใน micro-plot
4. ศึกษาประสิทธิภาพการละลายฟอสฟอรัสที่ถูกตรึงอยู่ในชุดดินต่างๆโดยเชื้อรา[/color]
ศึกษากับชุดดิน 5 ชุด ได้แก่ ชุดดินปากช่อง โคราช ยโสธร คลองชาก และทับกวาง วางแผนการทดลองแบบ randomized complete block มี 4 ซ้ำ 4 กรรมวิธีการทดลอง คือ
1. การไม่เพาะเชื้อรา
2.- 4. การเพาะเชื้อราที่คัดเลือกไว้ 3 ไอโซเลท (รูปที่ 1) คือ RPS 003 F, RPS 032 F และ RPS 145 Fตามลำดับ โดยเก็บดินชั้นไถพรวน (0-15 เซนติเมตร) ผึ่งแห้ง บดผ่านตะแกรงขนาด 2 มิลลิเมตร บรรจุ 200 กรัมในภาชนะมีฝาปิดขนาด 1000 มิลลิลิตร (รูปที่ 2) ปรับความชื้นดินให้เท่ากับ 60 เปอร์เซ็นต์ของความสามารถในการอุ้มน้ำของชุดดินนั้นๆ และรักษาระดับความชื้นนี้ตลอดการทดลอง เพาะเชื้อรา 3 ไอโซเลท คลุกผสมให้ทั่ว บ่มดินที่อุณหภูมิห้อง เมื่อครบเวลาบ่มที่ 1, 2, 4, 8 และ 12 สัปดาห์ เก็บตัวอย่างดินเพื่อวิเคราะห์ปริมาณฟอสฟอรัสที่เป็นประโยชน์ ทั้งรูป อนินทรีย์และอินทรีย์ โดยวิธี Bray 2 (Bray and Kurtz, 1945)และวิธี Olsen (Olsen, 1965) พร้อมกับทำการนับปริมาณเชื้อราที่มีชีวิตตามระยะเวลาบ่มที่กำหนดไว้
5. ศึกษาวิธีการผลิตปุ๋ยชีวภาพจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟตในห้องปฏิบัติการ[/color]เพื่อให้อยู่ในรูปแบบปุ๋ยชีวภาพจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟตที่พร้อมใช้ประโยชน์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ทำการทดลองในสภาพห้องปฏิบัติการ เชื้อราที่ใช้ทดลองผลิตคือ Penicillium sp. RPS 003 F มีขั้นตอนโดยย่อดังนี้
5.1 เลือกวัตถุดิบในการเลี้ยงเชื้อและขยายปริมาณ conidiospore ซึ่งเป็นส่วนขยายพันธุ์ที่เหมาะสมกับการจะนำมาผลิตเป็นปุ๋ยชีวภาพของเชื้อรา Penicillium sp. RPS 003 F จากข้อมูลเบื้องต้นที่ได้จากการทดลองเลี้ยงเชื้อรา Penicillium sp. RPS 003 F มาก่อน จึงใช้ข้าวฟ่างผสมรำข้าวหยาบอัตราส่วน 2:1 เป็นวัตถุดิบเลี้ยงขยายเชื้อ ส่วนวิธีการเลี้ยงขยายสปอร์เป็นแบบ solid substrate โดยบรรจุวัตถุดิบในถุงพลาสติค ชนิดทนร้อนขนาด 5x8 นิ้วถุงละ 100 กรัม สวมคอขวด พลาสติคทนร้อน อุดจุกด้วยสำลี นึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอโดยใช้ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้วเป็นเวลา 20 นาที แล้วเพาะเชื้อรา Penicillium sp.RPS 003 F ลงในถุงที่เตรียมไว้ เก็บบ่มไว้ที่อุณหภูมิห้อง
5.2 ศึกษาหาวัสดุพาหะที่เหมาะสม โดยเพาะเชื้อราลงในวัสดุอินทรีย์ชนิดต่างๆที่ทดลองใช้เป็นวัสดุพาหะได้แก่ ปุ๋ยหมักมูลวัวบดละเอียด กากตะกอนหม้อกรองโรงงานน้ำตาล และดินพีท เก็บบ่มไว้ที่อุณหภูมิห้อง ตรวจนับปริมาณเซลล์เชื้อราทุกระยะเวลา 0 5 15 30 60 90 120 180 240 และ 360 วัน เมื่อได้วัสดุพาหะที่เหมาะสม ผสมหินฟอสเฟตลงไป แล้วอัดเม็ดด้วยเครื่องบดเนื้อโดยผสมหินฟอสเฟตลงไปพร้อมกัน ใช้กากน้ำตาล 0.5 เปอร์เซ็นต์เป็นสารเชื่อมการอัดเม็ด
5.3 ศึกษาการมีชีวิตรอดของเชื้อรา Penicillium sp. RPS 003 F ในปุ๋ยชีวภาพที่ผลิตได้เมื่อใส่ลงดินจากจังหวัดต่างๆ วางแผนการทดลองแบบ randomized complete block ทำ 4 ซ้ำ
กรรมวิธีการทดลองมี
1) ดินขอนแก่น นึ่งฆ่าเชื้อ
2) ดินขอนแก่น ไม่นึ่งฆ่าเชื้อ
3) ดินเพชรบุรี นึ่งฆ่าเชื้อ
4) ดินเพชรบุรี ไม่นึ่งฆ่าเชื้อ
5) ดินลพบุรี นึ่งฆ่าเชื้อ
6) ดินลพบุรี ไม่นึ่งฆ่าเชื้อ
7) ดินสุพรรณบุรี นึ่งฆ่าเชื้อ
8. ดินสุพรรณบุรี ไม่นึ่งฆ่าเชื้อ
ใส่ดินทดลองในจานเพาะเชื้อขนาด 20 x 150 มม. การทำให้ดินปลอดเชื้อโดยการนึ่งฆ่าเชื้อดินในหม้อนึ่งความดันไอ ใส่ปุ๋ยชีวภาพที่ผลิตได้ลงดิน โดยให้ปริมาณเชื้อเริ่มต้นเท่ากัน ตรวจนับปริมาณเชื้อรา RPS 003 Fทุกระยะเวลา 0 5 15 30 60 90 120 180 240 และ 360 วัน
ผลการทดลองและวิจารณ์
1. การรวบรวมจุลินทรีย์ละลายฟอสเฟต
เลี้ยงแยกจุลินทรีย์จากตัวอย่างดินและรากพืชที่เก็บจากจังหวัดต่างๆ ในภาคเหนือ ภาคใต้
ภาคตะวันออกเฉียงเหนือและภาคกลางจำนวนรวมกัน 172 ตัวอย่าง เป็นดินรอบรากพืชจำนวน 80 ตัวอย่างและรากพืชจำนวน 92 ตัวอย่าง ผลการทดลองเป็นดังนี้ จากตัวอย่างทั้งหมดได้จุลินทรีย์ที่สามารถละลายตะกอน CaHPO4 ใน 3 วัน ได้วงใสรอบโคโลนีของจุลินทรีย์ กว้างระดับ 5 (วงใสกว้างมากกว่า 9 มิลลิเมตร) จำนวน 60 ไอโซเลท จุลินทรีย์ที่สามารถละลายตะกอน CaHPO4 ได้วงใสกว้างมากกว่า 9 มิลลิเมตร ส่วนมากเป็นเชื้อราและส่วนหนึ่งเป็นเชื้อรา Penicillium sp. ความสามารถในการละลายตะกอน CaHPO4 น้อยลงมา คือ จุลินทรีย์ประเภทเชื้อแบคทีเรียและเชื้อแอคติโนมัยซีสตามลำดับ
2. หินฟอสเฟตลำพูน ได้จุลินทรีย์ 5 ไอโซเลทที่มีประสิทธิภาพ เป็นจุลินทรีย์ประเภทราเส้นใยจำนวน 3 ไอโซเลท ซึ่งทั้งหมดเป็นราในจีนัส Penicillium sp. และจุลินทรีย์ประเภทแบคทีเรีย 2 ไอโซเลท
3. ศึกษาการใช้จุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้ร่วมกับหินฟอสเฟตใน micro-plot และแปลงทดลอง
เมื่อนำจุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้มาทดลองใช้ร่วมกับหินฟอสเฟตใน micro-plot (รูปที่ 11-12) พบว่าเชื้อราทั้ง 3 ไอโซเลท คือ Penicillium spp. RPS 003 F, RPS 032 F และ RPS 145 F มีประสิทธิภาพสูงกว่าเชื้อแบคทีเรีย เมื่อคำนวณค่าเฉลี่ยผลผลิตของถั่วเหลืองและข้าวโพดจากผลการทดลองใน micro-plot 15 แปลงและแปลงทดลอง 10 แปลง พบว่าถั่วเหลืองใน micro-plot การเพาะเชื้อราร่วมกับหินฟอสเฟตให้น้ำหนักเมล็ดมากกว่าการใส่เฉพาะหินฟอสเฟต 92.9 เปอร์เซ็นต์ และสำหรับข้าวโพด การเพาะเชื้อราร่วมกับหินฟอสเฟตให้น้ำหนักเมล็ดมากกว่าการใส่หินฟอสเฟตเพียงอย่างเดียว 93.3 เปอร์เซ็นต์ ในสภาพแปลงทดลอง พบว่าการเพาะเชื้อรา Penicillium spp. ร ่วมกับการใส่หินฟอสเฟตอัตราต่ำ ทำให้การเจริญเติบโตของพืชทดสอบสูงกว่าการใส่หินฟอสเฟตแต่ไม่เพาะเชื้อรา โดยรวมแล้วการเพาะเชื้อราร่วมกับหินฟอสเฟตทำให้ผลผลิตถั่วเหลืองและข้าวโพดเพิ่มขึ้นจากการไม่เพาะเชื้อรา 28.3 และ 27.6 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ
4. ศึกษาประสิทธิภาพการละลายฟอสฟอรัสที่ถูกตรึงอยู่ในชุดดินต่างๆ โดยเชื้อรา พบว่า การเพาะเชื้อรา Penicillium spp. ที่คัดเลือกไว้ลงในชุดดินต่างๆ ทำให้ค่าฟอสฟอรัสทั้งหมดที่เป็นประโยชน์ในดินสูงขึ้นกว่าการไม่เพาะเชื้อรา และเมื่อวิเคราะห์รูปของฟอสฟอรัสที่เป็นประโยชน์ (อนินทรีย์และอินทรีย์ฟอสฟอรัส) พบเช่นกันว่ามีการเพิ่มขึ้นเมื่อมีการเพาะเชื้อรา โดยเฉพาะอินทรีย์ฟอสฟอรัสมีการเพิ่มขึ้นอย่างเด่นชัด
5. ศึกษาวิธีการผลิตปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟตในห้องปฏิบัติการพบว่า การเลี้ยงขยายปริมาณ conidiospore ของเชื้อรา Penicillium sp. โดยวิธี solid-substrate fermentation ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีข้าวฟ่างเป็นส่วนประกอบหลักทำให้ได้สปอร์ปริมาณประมาณ 1.0 x 108 สปอร์ต่อกรัมและมี shelf life ที่นานพอเพียงกับการนำไปใช้ประโยชน์ ประมาณ 60 วัน วัสดุพาหะที่เหมาะสมกับเชื้อรา Penicillium sp. RPS 003 F คือ [color=red][b]ปุ๋ยหมักมูลวัว โดยมีแนวโน้มที่เมื่อบ่มเป็นเวลานาน ปุ๋ยหมักมูลวัวมีปริมาณเชื้อรารอดชีวิตมากกว่าวัสดุทดลองอื่นๆ รวมทั้งเมื่อพิจารณาในเรื่องราคาความสะดวกในการจัดหาและคุณภาพของวัตถุดิบที่จะใช้เป็นวัสดุพาหะในการผลิตเชื้อปุ๋ยหมักมูลวัว บดละเอียด จึงเหมาะสมที่จะใช้เป็นวัสดุพาหะสำหรับการผลิตปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟตในเบื้องต้น [/b][/color] และเมื่อทดลองใส่ปุ๋ยชีวภาพรูปแบบที่ผลิตได้ลงดินชุดต่างๆ เพื่อศึกษาความสามารถในการมีชีวิตรอด พบว่าเชื้อรา Penicillium sp. RPS 003 F ในปุ๋ยชีวภาพ มีชีวิตรอดในชุดดินต่างๆได้จนถึง 12 เดือน
สรุปผลการทดลอง
สามารถรวบรวมเชื้อจุลินทรีย์ที่ละลายตะกอน CaHPO4 ได้ความกว้างของวงใสรอบโคโลนี.จุลินทรีย์มากกว่า 9 มิลลิเมตร จำนวน 60 ไอโซเลท. จำแนกเป็นแบคทีเรีย 27 ไอโซเลท. ราเส้นใย 33 ไอโซเลท.เมื่อคัดเลือกจุลินทรีย์ที่รวบรวมไว้โดยให้ละลายหินฟอสเฟต 2 ชนิด ผลการคัดเลือกได้ จุลินทรีย์ 5ไอโซเลท.โดยแยกเป็นราเส้นใยจำนวน 3 ไอโซเลท. ซึ่งทั้งหมดเป็นราในจีนัส Penicillium sp. และแบคทีเรีย 2 ไอโซเลท.
เมื่อนำจุลินทรีย์ที่คัดเลือกไว้มาทดลองใช้ร่วมกับหินฟอสเฟตใน micro-plot และในสภาพแปลงทดลอง พบว่า จุลินทรีย์ประเภทเชื้อราทั้ง 3 ไอโซเลท คือ Penicillium spp. RPS 003 F, RPS 032 F และ RPS 145 F มีประสิทธิภาพสูงกว่าเชื้อแบคทีเรีย
ศึกษาประสิทธิภาพการละลายฟอสฟอรัสที่ถูกตรึงอยู่ในชุดดินต่างๆโดยเชื้อรา Penicillium spp. 3 ไอโซเลท พบว่า การเพาะเชื้อราทำให้ค่าฟอสฟอรัส.ทั้งหมดที่เป็นประโยชน์ในดิน อนินทรีย์ฟอสฟอรัส.และอินทรีย์ฟอสฟอรัส. เพิ่มขึ้นเมื่อมีการเพาะเชื้อรา โดยเฉพาะอินทรีย์ฟอสฟอรัส.มีการเพิ่มขึ้นอย่างเด่นชัดสูงขึ้นกว่าการไม่เพาะเชื้อรา
การศึกษาวิธีการผลิตปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต.ในห้องปฏิบัติการพบว่าวิธี solid-substrate
fermentation ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี ข้าวฟ่าง เป็นส่วนประกอบหลักเหมาะสำหรับการเลี้ยงขยายปริมาณสปอร์ของเชื้อรา Penicillium sp. เพราะทำให้ได้สปอร์ปริมาณมากและมี shelf life ที่นานพอเพียง ส่วนวัสดุพาหะที่เหมาะสมสำหรับการผลิตปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต. คือ ปุ๋ยหมักมูลวัวบดละเอียด นอกจากนี้เมื่อนำปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟต.ไปใส่ชุดดินต่างๆ พบว่าเชื้อราในปุ๋ยชีวภาพมีชีวิตรอดได้จนถึง 12 เดือน โดยยังคงมีปริมาณเชื้อมีชีวิต 104 – 105 เซลล์ต่อกรัมของดิน
การนำไปใช้ประโยชน์
ผลิตภัณฑ์ปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟตสามารถนำมาใช้เพิ่มประสิทธิภาพของปุ๋ยหินฟอสเฟต
ซึ่งจัดเป็นปุ๋ยฟอสเฟตราคาต่ำ และเป็นปุ๋ยที่ปลดปล่อยธาตุอาหารฟอสฟอรัสออกมาทีละน้อย (slow release) อีกทั้งสามารถนำมาใช้ละลายฟอสฟอรัสที่มีอยู่แล้วในดินให้ออกมาเป็นประโยชน์อีกครั้ง ซึ่งฟอสฟอรัสในดินดังกล่าวมาจากปุ๋ยเคมีฟอสเฟตที่ใส่ลงดินให้กับพืชขณะเพาะปลูก แต่พืชสามารถดูดใช้ได้บางส่วน โดยส่วนใหญ่แล้วเหลือตกค้างในดินโดยดินยึดตรึงเอาไว้ ดังนั้นถ้าใช้ผลิตภัณฑ์ปุ๋ยชีวภาพละลายฟอสเฟตตามแนวทางนี้กับดินทำการเกษตรทั่วไป จะทำให้ลดการใช้ปุ๋ยฟอสเฟตลงได้ ซึ่งจากผลการทดลองพบว่าการใช้จุลินทรีย์ละลายฟอสเฟตทำให้ความเป็นประโยชน์ของฟอสฟอรัสในดินเพิ่มขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งอินทรีย์ ฟอสฟอรัสที่ถือเป็นแหล่งสำรอง (reserve pool) ของฟอสฟอรัสที่เป็นประโยชน์ต่อพืชได้อย่างต่อเนื่อง
เอกสารอ้างอิง
ประพิศ แสงทอง. 2534. อนินทรีย์และอินทรีย์ฟอสฟอรัสในดินไร่ วารสารดินและปุ๋ย 13(2): 142-152.
ลัดดาวัลย์ มีสุข, เพ็ญศรี ชูวรเวช, ยุพิน สรวิสูตร, จันทิรา อริยธัช, เรวดี ดีมาก และภาวนาฏ เสมรสูต. 2529.
การเพิ่มประสิทธิภาพของหินฟอสเฟตโดยเผาที่อุณหภูมิต่ำ. วารสารวิชาการเกษตร 4 (1) :17-24.
วิศิษฐ์ โชลิตกุล และมนูเวทย์ ศรีเสน. 2520. ปุ๋ยฟอสเฟตและโพแทสเซียม. รายงานการสัมมนาทางวิชาการเรื่อง อุตสาหกรรมปุ๋ยกับการเกษตร หน้า 85-130.
ที่มา : กรมวิชาการเกษตร
สงวนลิขสิทธิ์โดย © ++kasetloongkim.com++ All Right Reserved.
